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作者:
李莎
摘要:
内生菌是指生活于健康植物组织内部的微生物.研究表明,中药内生菌能产生丰富的代谢产物,包括与宿主相同或不相同的化学成分.冬虫夏草为麦角菌科虫草属真菌冬虫夏草菌Cordyceps sinensis Sacc.寄生在蝙蝠蛾科Hepialus armoricanus Oberthuk昆虫幼虫上的子座及幼虫尸体的复合物.
有相关文献报道,冬虫夏草中存在多种内生菌,从中分离得到的部分内生菌所产生的次级代谢产物表现出不同的生物活性.为了寻找结构新颖,有高活性的化合物,我们从新鲜的冬虫夏草中分离出内生菌,并对其次级代谢产物化学成分进行研究.为了使冬虫夏草内生菌在实验室培养条件下,产生丰富的次级代谢产物,从而增大产生具有生物活性化学成分的可能性.
我们在其发酵液中加入5种表观遗传修饰剂:5-AC,地西他滨,SAHA,丁酸钠,丙戊酸,以刺激其沉默基因的表达.对加入修饰剂的发酵液和未加入修饰剂的发酵液用乙酸乙酯萃取,并对萃取液进行HPLC分析,比较加入修饰剂与未加入修饰剂的HPLC图谱.选择代谢产物丰富,种类相对较多,极性适中且加入修饰剂与未加入修饰剂的HPLC图谱变化明显且稳定的菌株作为后续研究对象.
我们选择了冬虫夏草一株内生真菌烟曲霉Aspergillus fumigatus,在其发酵液中加入SAHA,进行扩大发酵,对其发酵液用乙酸乙酯萃取,并对所得的萃取物进行化学成分研究,采用正相硅胶,葡聚糖凝胶sephadex LH-20等柱色谱方法以及制备和半制备色谱法进行分离纯化,对所得化合物用波谱分析的方法进行结构鉴定.对已结构鉴定的化合物进行活性测试.从中分离并鉴定了32个化合物:
- 1a(S)-3,6-二羟基-8-甲氧基-3-甲基苯并二氢吡喃-4-酮((S)-3,6-dihydroxy-8-methoxy-3-methylisochroman-4-one),
- 1b(R)-3,6-二羟基-8-甲氧基-3-甲基二氢苯并噻喃-4-酮((R)-3,6-dihydroxy-8-methoxy-3-methylisochroman-4-one),
- 2 8-甲氧基-3-甲基异苯并二氢吡喃-3,6-二醇(8-methoxy-3-methylisochromane-3,6-diol),
- 3 3,8-二甲氧基-3-甲基苯并二氢吡喃-6-醇(3,8-dimethoxy-3-methylisochroman-6-ol),
- 4 3,6,7,8-四甲氧基-3-甲基苯并二氢吡喃(3,6,7,8-tetramethoxy-3-methylisochromane),
- 5 6-甲氧基-3-甲基-1H-异苯并吡喃-8-醇(6-methoxy-3-methyl-1H-isochromen-8-ol),
- 6a(3S,4R)-8-甲氧基-3-甲基异苯并二氢吡喃-3,4,6-三醇((3S,4R)-8-methoxy-3-methylisochromane-3,4,6-triol),
- 6b(3R,4S)-8-甲氧基-3-甲基异苯并二氢吡喃-3,4,6-三醇((3R,4S)-8-methoxy-3-methylisochromane-3,4,6-triol),
- 7a(3S,4S)-8-甲氧基-3-甲基异苯并二氢吡喃-3,4,6-三醇((3S,4S)-8-methoxy-3-methylisochromane-3,4,6-triol),
- 7b(3R,4R)-8-甲氧基-3-甲基异苯并二氢吡喃-3,4,6-三醇((3R,4R)-8-methoxy-3-methylisochromane-3,4,6-triol),
- 8 3,6,8-三甲氧基-3-甲基异苯并二氢吡喃(3,6,8-trimethoxy-3-methylisochromane),
- 9 5-(3-羟基-6-甲基庚-5-烯-2-亚基)-甲基亚环己-1-醇(5-(3-hydroxy-6-methylhept-5-en-2-ylidene)-methylenecyclohexan-1-ol),
- 10 5-(3-羟基-6-甲基庚-5-烯亚2-甲基)-2-甲基环己-1-醇(5-(3-hydroxy-6-methylhept-5-en-2-ylidene)-2-methylenecyclohexan-1-ol),
- 11 5-(3-羟基-6-甲基庚-5-烯-2-亚基)-2-甲基环己-1-醇(5-(3-hydroxy-6-methylhept-5-en-2-ylidene)-2-methylenecyclohexan-1-ol),
- 12 3-(3-羟基-4-亚甲基亚)-2-(3-甲基丁-2-烯-1-基)氧杂环丁烷-2-醇(3-hydroxy-4-methylenecyclohexylidene)-2-(3-methylbut-2-en-1-yl)oxetan-2-ol),
- 13(2R,3S,5S,10R)-1-羟基-4-甲基-6-亚甲基-2-(2-甲基丙-1-烯-1-基)双环[3.3.1]壬烷-3-酮((2R,3S,5S,10 R)-1-hydroxy-4-methyl-6-methylene-2-(2-methylprop-1-en-1-yl)bicyclo[3.3.1]nonan-3-one),
- 14 Colletotrichine A,
- 15(4R S)-4,8-二羟基-3,4-二氢萘-1(2H)-酮((4R S)-4,8-Dihydroxy-3,4-dihydronaphthalen-1(2H)-one),
- 16 N-(2-羟基苯基)-乙酰胺(N-(2-Hydroxyphenyl)-acetamide),
- 17环-(S-脯氨酸-R-亮氨酸)(cyclo-(S-Pro-R-Leu)),
- 18 callyspongidipeptide A,
- 19环-(S-脯氨酸-R-缬氨酸)(cyclo-(S-Pro-R-Val)),
- 20 fumitremorgin C,
- 21 fumiquinazoline A,
- 22 5a,6-脱氢-3-脱羟甲基二硫代-3,10a双(甲硫基)胶霉毒素(5a,6-dehydro-3-dehydroxymethylbisdethio-3,10a-bis(methylthio)gliotoxin),
- 23双硫双-(甲硫基)胶霉毒素(bis(dethio)bis-(methylthio)gliotoxin),
- 24胶霉毒素(gliotoxin),
- 25疣孢青霉原(verruculogen)
- 26 12,13-二羟基烟曲霉素C(12,13-dihydroxyfumitremorgin C),
- 27乙酰苯胺(acetanilide),
- 28 pseurotin A,
- 29Cephalimysin A.
包括12个聚酮类,10个二酮哌嗪类,6个倍半萜类,2个乙酰苯胺类,2个其他类.其中16个新化合物(1a~13);其中包括5个倍半萜类(9~13),11个聚酮类(1a~8).对部分新化合物进行细胞毒活性测试,发现新化合物1a,2对MV4-11(人急性白血病细胞株)有弱的细胞毒活性;化合物5对H1299(人肺癌细胞),H460(大细胞肺癌细胞),HGC-27(人胃癌细胞),A549(人非小细胞肺癌细胞)和mnk-43(人胃癌高分化细胞)五种细胞株均有弱的细胞毒活性.
关键词:
冬虫夏草;内生菌;烟曲霉;表观遗传修饰;化学成分
学位级别:
硕士
DOI:
CNKI:CDMD:2.1018.890214